高效减少组织自发荧光 ——提高免疫荧光分析中的信噪比  

免疫荧光技术是现代生物学和医学中的常用的一种实验技术。该方法灵敏度高，可使用荧光显微镜对组织样本进行分析。该技术利用荧光分子标记的抗体对与之相结合的抗原进行定位，可对蛋白质、聚糖蛋白、小生物分子和非生物分子进行清晰的亚细胞可视化研究。但是，组织中的自发荧光往往会严重干扰这一技术的发展。如这篇文章所述，目前，已经研发出一项技术，其可显着降低组织的自发荧光，提高染色结果的信噪比。

自发荧光是指在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的、背景荧光信号的统称。组织切片中的红细胞（RBCs）和胶原蛋白等成分可产生很强的自发荧光，其严重影响目的信号的辨别。此外，组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也能产生大量的自发荧光。

组织产生的自发荧光对组织切片的检测结果造成了很大的困扰，尤其对使用绿色和红色通道荧光的检测。尽管目前的技术手段已经避免了红色/远红外波长产生的自发荧光，但某些情况下，在600-700nm波长范围内仍然可能产生组织的自发荧光。

组织自发荧光产生的原因主要来自于组织本身的组分。主要包括黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞和脂褐素等。这些组分通常在可见光谱的绿色和黄色波长范围内产生荧光。而免疫荧光技术中最常用的荧光染料是绿色波长通道的荧光素和Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）。组织中这些天然成分发出的自发荧光显著影响实验结果的信噪比。

除去组织切片自身的原因，组织固定中经常使用的甲醛、戊二醛和福尔马林等也会造成组织的自发荧光。由于固定剂本身造成的高背景荧光，许多使用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织样品，尤其是肾脏/脾脏的组织样本，非常不适用于免疫荧光检测。这是由于福尔马林可在蓝色、绿色和红色波长光谱范围上产生大量的自发荧光。

目前，关于由组织固定导致自发荧光显著增加的机理尚不清楚。甲醛和戊二醛均可通过形成共价交联来稳定组织结构。由于与醛反应的蛋白侧链种类繁多，反应动力学、可逆性以及交联剂复杂的化学性质使得产生交联的化学结构各异。这可能也是导致自发荧光机理尚不明确的主要原因之一。

确定减少自发荧光的技术方法

FFPE组织中产生的自发荧光很可能是由于C = C键或C = N键的存在。为了解决这一问题，有些研究，利用硼氢化钠来还原C = C和C = N键以减少组织的自发荧光。然而，硼氢化物和与之类似的还原剂在中性pH环境下很不稳定。研究人员发现，尽管硼氢化钠可成功的减少组织中的一些自发荧光，但该方法的可重现性低、试剂处理难度很大。

用于减少组织自发荧光的另外一种方法是光漂白。使用该方法时，组织切片长时间暴露于高强度UV辐射下，组织中的成分发生不可逆的光氧化作用。有研究证明，光漂白与其他处理结合使用可有效的降低自发荧光。但该方法耗时太长。另外，大多数免疫组化实验室均缺乏光漂白方法所需的仪器设备。

历史上，用于降低组织自发荧光的主要方法是用苏丹黑或类似的非荧光重氮染料溶液处理组织。这些疏水染料可与组织切片进行非特异性结合，结合后的染料（苏丹黑）通过吸收入射光来降低组织的自发荧光（暗淬灭）。

具体来说，苏丹黑对降低组织中由脂褐素引起的自发荧光非常有效。脂褐素是一种很明亮的荧光色素，在一些组织中随着年龄的增长而积累。脂褐素颗粒由溶酶体消化的脂质残基组成。由于苏丹黑的疏水特性，其能有效地结合富含脂质的脂褐素颗粒并掩盖其产生的自发荧光。但是，苏丹黑对醛固定、结缔组织和红细胞产生的自发荧光效果较差。

新技术

目前，一种减少组织切片自发荧光的新技术已经应运而生。该方法可显著减少由于福尔马林固定、胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞导致的自发荧光。这项新技术以Vector^® True VIEW™ Auto fluorescence Quenching Kit形式销售。该技术使用亲水性的水溶液处理组织切片，可静电结合胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞。此外，这种无荧光、带负电的水溶性分子也能有效地结合组织中的福尔马林，包括结肠、胰腺组织、前列腺、扁桃体、脾脏、肾脏、胆囊和胸腺等组织。

一旦结合，TrueView淬灭剂便可显著降低组织中的自发荧光。这种试剂很可能通过静态和暗淬灭机制相结合的方式来降低组织中的自发荧光。

由于TrueVIEW Quencher的亲水性特征，组织切片的处理也是在水溶性缓冲液中进行的，因此并不需要70％乙醇预处理步骤。 此外，在免疫荧光实验结束时，只需使用TrueVIEW Quencher处理两分钟即可。更重要的是，TrueVIEW淬灭剂可与常见的大部分荧光基团兼容，例如荧光素、Alexa荧光剂、DyLight荧光剂、Cyanine荧光剂以及绿色荧光蛋白等。

TrueView Quencher处理方法的实用性已在脾脏组织（Fig1A和1B）和胰腺组织（图1C和1D） 的实验结果中得到证实。未经处理的脾脏组织，在绿色通道中发生了很强的自发荧光，这些自发荧光严重干扰了Ki67的信号（图1A）。经TrueView Quencher处理后，在黑色背景中，可清晰看到Ki67的亮绿色的目的信号（图1B）。此外，图1还证明了使用TrueView Quencher处理胰腺组织的有效性：经处理后，组织中绿色和红色波长处的自发背景荧光大大降低（图1C和1D）。 图2证实了TureView Quencher可降低肾组织中绿色和红色自发背景荧光，并可保证其正常的DAPI（蓝色通道）核染色。

 图1. 显著降低的自发荧光可揭示靶抗原的真正定位。上图A、B为人脾脏(FFPE)组织染色结果: 使用anti-Ki67（绿色）和anti-CD20(红色)。 (A)未经任何处理；（B）经TrueVIEW处理；上图C、D为人胰腺组织染色结果：使用anti-Insulin（绿色）和anti-END(红色)。（C）未经任何处理；（D）经TrueVIEW处理。

图2.减少绿色和红色通道的自发荧光。使用DAPI对经抗原修复的人肾脏组织（FFPE组织）进行核染色。绿/蓝通道：（A）未经任何处理，（B）经TrueVIEW处理。 红/蓝色通道:（C）未经任何处理，（D）经TrueVIEW处理。

目前，针对可以降低组织自发荧光产品的担忧主要是使用其处理组织后对目的信号（通常是荧光基团连接的二抗）产生的影响。理想情况下，可以达到降低组织中的自发荧光而不影响二抗荧光信号的目的。

使用TrueVIEW Quencher处理组织后，自发背景荧光显著减少。同时也会对其二抗荧光造成一定的损失。可通过使用更高浓度抗体（图3）或延长曝光时间来弥补这一影响。综合考虑，在大多数免疫荧光检测中，使用Vector True VIEW Autofluorescence Quenching试剂可显著提高整个实验结果的信噪比。

图3.抗原修复的人肾脏（FFPE组织）染色结果：使用anti-AE1 / AE3（绿色）标记。（A）未经处理 （B）经TrueVIEW处理。 一抗浓度增大2倍可实现最佳的信噪比（图B）。A图中的箭头部位代表B图中去除的自发背景荧光。

总结

在发展扩大的免疫荧光技术领域，现在已经开发出一种新颖的方法，该方法操作快速、简单实用，并可用于具体严重自发荧光的FFPE标本。该方法在基于组织的免疫荧光检测中具有广泛的应用，并可与标准荧光和共聚焦激光显微镜的激光相兼容。注意：该试剂对脂褐素造成的自发荧光无效。Vector^® True VIEW™ Auto fluorescence Quenching Kit产品详情请联系Vector中国区独家授权代理商——欣博盛生物。

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