1、天然Tregs和诱导性Tregs的区别是什么？

天然T细胞来源于胸腺CD4+细胞中高表达CD25并表达转录因子Foxp3的细胞，不受环境中细胞因子的影响(属于细胞因子非依赖型）。天然Tregs大约占CD4+细胞5-10% 可以在T淋巴细胞发育的单阳性阶段首先出现，并由于具有与自身抗原的高亲和力而被阳性选择。此信号传递是通过T细胞受体和胸腺基质细胞上的带有自身抗原肤的MHC 复合体相互作用完成。

另一方面，诱导性Tregs (iTregs) 来源于胸腺CD4单阳性细胞，当有足够的同源抗原刺激或者特异性免疫调节细胞因子如TGF-β，IL-10 and IL-4存在时，可以分化成CD25+，并表达FoxP3 的Tregs一 因此称为“适应性”或“诱导性”Tregs。 根据调节因子的不同，适应性或诱导性Tregs又被进一步分为Tr1，Tr2，或Tr3细胞。

2、小鼠和人CD4+Tregs有区别吗？

有的。在小鼠中，CD4+Tregs是一组同源性细胞群，所有的CD4+及CD25+细胞均为调节性T细胞。人类的Tregs是异质性细胞群，并不是所有的CD25+细胞都是Tregs。这一研究最早是由哈佛大学、the Royal Free and University College Medical School的科研人员通过对人CD4+CD25+细胞进行详细分析时观察到的。

研究结果显示，只有体外高表达CD25 (约占总CD4 T细胞2-3%) 的CD4+T细胞在体外才有抑制活性，这是相对与把表达CD25的细胞都当做Tregs的小鼠细胞而言，而且表达低到中等水平CD25的细胞在体外没有抑制活性。

3、Tregs在CD4+细胞中的比例是多少？ 此比例是否随着人年龄的增长而发生改变？

此数据也是4-9% (未经发表的内部统计数据)。然而即使在健康的捐赠者中，此数据也会有一定程度的改变。CD4+CD127loCD25+ Tregs的平均百分比在人的一生中只会发生轻微的增长（在人成年之后的20岁到25岁期间，其比例会从脐带血的6.10%增加到PBMCs的7.22%；到人类60岁时，PBMCs中的比例会达到7.5%）。研究显示，在健康的人及小鼠，CD4+/CD25+Tregs比值都会随着年龄的增加发生轻度增长。然而增长的Tregs数量与棉衣衰老质检确切的联系尚不明确

4、为什么把CD127作为人Tregs的标志至关重要？

来自Barbara Fazekas de St. Groth (Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biotogy, Sydney, Australia) and Jeffrey Bluestone (UCSF Diabetes Center,San Francisco,CA)实验室的数据显示低表达CD127可以区别鉴定人Tregs。其低表达与FoxP3密切相关，并且显示CD127loCD25int/hi的CD4+T淋巴细胞就是Tregs。CD127low优于胞内表达的FoxP3的地方在于检测时不需要固定和破膜，细胞仍然存活，所以随后可用于培养或其他的体外实验。当用CD25的高表达判定Tregs时，研究人员可从正常的细胞群体中获得0.6%-7.9%的Tregs。而用CD127的低表达 (结合CD25) 作为新的圈门标准通常会得到单独用CD25high圈门而丢失的细胞。 此方法分选的CD25int/high Treg细胞比单独用CD25high圈门方式分选的Treg细胞的回收率增加了2-4倍，而且减少了CD25-/int效应细胞的污染。

5、哪些表面标志可分别用来鉴定人及小鼠CD4+T细胞？

目前推荐的判定人CD4 Tregs细胞的表面标志包括GITR，CTLA4 (细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白) ，CD39，CD62L，CDl27，CDl03以及结合CD45RA+表达的 LAG3(淋巴细胞活化基因 ) 。在小鼠中，FR4hiCD25+为n Tregs，FRloCD25+为效应T细胞，FR4hiCD25-为记忆T细胞，CD2S-CD4+为初始T细胞 。

6、什么是Foxp3？如何与CD4+T调节性T细胞相结合？

Foxp3 ((forkhead box P3) 是种胞内转录因子，是Tregs的特异性标志。在小鼠淋巴细胞增生性疾病的研究中被发现，而且在小鼠自发性基因突变“scurfy ”中可被检测到。在人类，由于FoxP3基因缺失可导致IPEX，所以Foxp3可有助于恶性自身免疫病IPEX (immunedysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked)的研究。

7、除了CD4细胞，是否还有其他类型的细胞也可表达Foxp3？

是的。有研究显示CD8细胞也可表达FoxP3，而且天然状态下也具有调节功能 。

8、人Foxp3是否存在多种异构体？BD Biosesciences Foxp3 clone 259D/C7可识别哪种异构体？

有的。Foxp3有两种异构体：全长形式和缺乏外显子2的剪接变体。CD4+/CD25+细胞均可表达这两种异构体。

9、做抗人的Foxp3染色之前，样本可保存多久？

样本染色之前，-80℃保存人的PBMCs于人FoxP3缓冲液中24-72小时都是可行的。

10、小鼠Foxp3抗体可用于人Foxp3缓冲液吗？反过来是否可行？

不行。我们不建议互换人与小鼠的Foxp3缓冲液体系。要想得到小鼠或人FoxP3克隆最好的染色结果，我们建议参照不同克隆推荐的最适缓冲体系进行试验。

11、Foxp3染色是否可应用于人全血细胞样本？

可以。选择pBMCs作为高速细胞计数样本的首要原因，就是需要溶解/固定/破膜大量的全血以得到实验所需的足够的细胞数量。例如1ml全血含有大约1x10^6个淋巴细胞，而只有少于4-9%的CD4+细胞是Tregs。

12、如何检测Tregs功能？

Tregs可根据其对靶细胞功能的抑制能力进行检测，例如：

抑制靶细胞增殖或者

抑制靶细胞的细胞因子分泌

抑制标志物的活化

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