FluoroSpot荧光免疫斑点实验可用于单细胞水平上检测多种细胞因子的分泌。和ELISpot一样，是一种灵敏、操作简单的方法。在FluoroSpot实验中，不同细胞因子的单抗混合物用到了夹心法中。不同于ELISpot，FluoroSpot使用的是荧光标记的检测试剂。一种分析物用生物素化抗体检测，另外一种分析物使用tag标记的抗体检测。这种实验方法的设计保证了可以在同一孔内进行2种细胞因子的检测。接下来使用红色荧光标记的Streptavidin和绿色荧光标记的抗tag抗体进行信号的级联放大。使用自动荧光读板仪分析产生的2种颜色的荧光斑点并生成图像。图像叠加后上显示在相同位置的荧光斑点表示为同时分泌2种细胞因子的细胞。
图1 FluoroSpot检测原理 图2 白色念珠菌提取物处理和未处理的PBMC细胞(300,000 cells/well)过夜培养后，使用FluoroSpot检测分泌 IFN-γ 和 / 或IL-22的细胞。使用AID (Autoimmun Diagnostika GmbH)
公司的iSpot分析仪进行斑点分析。在FITC (IFN-γ) 和 Cy3
(IL-22)叠加图片上相同位置显示的斑点表示为同时分泌IFN-γ
和 IL-22的细胞。
FluoroSpot试剂盒信息
人FluoroSot试剂盒 |
产品名称 | 编号 | 供应商 |
Human IgG/IgA FluoroSpot kit | FS-05R06G | Mabtech |
Human IgG/IgM FluoroSpot kit | FS-05R17G | Mabtech |
Human IgG/IgA/IgM FluoroSpot kit | FS-050617 | Mabtech |
Human IFN-γ/Granzyme B FluoroSpot kit | FS-0110 | Mabtech |
Human IFN-γ/Granzyme B FluoroSpot kit, pre-coated | FSP-0110 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | FS-0102 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit, pre-coated | FSP-0102 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-5 FluoroSpot kit | FS-0108 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-13 FluoroSpot kit | FS-0104 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-17A FluoroSpot kit | FS-0103 | Mabtech |
Human IFN-γ/IL-22 FluoroSpot kit | FS-0118 | Mabtech |
Human IL-1β/GM-CSF FluoroSpot kit | FS-1215 | Mabtech |
Human IL-1β/IL-6 FluoroSpot kit | FS-1213 | Mabtech |
Human IL-1β/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | FS-1214 | Mabtech |
Human IL-1β/TNF-α FluoroSpot kit | FS-1209 | Mabtech |
Human IL-6/GM-CSF FluoroSpot kit | FS-1315 | Mabtech |
Human IL-6/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | FS-1314 | Mabtech |
Human IL-6/TNF-α FluoroSpot kit | FS-1309 | Mabtech |
Human TNF-α/GM-CSF FluoroSpot kit | FS-0915 | Mabtech |
Human TNF-α/IL-12/-23 (p40) FluoroSpot kit | FS-0914 | Mabtech |
猴FluoroSot试剂盒 |
Monkey IgG/IgA FluoroSpot kit | FS-05R24G | Mabtech |
Monkey IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | FS-2122 | Mabtech |
小鼠FluoroSot试剂盒 |
Mouse IFN-γ/IL-2 FluoroSpot kit | FS-4142 | Mabtech |
Mouse IFN-γ/IL-5 FluoroSpot kit | FS-4143 | Mabtech |
Mouse IFN-γ/IL-17A FluoroSpot kit | FS-4144 | Mabtech |
*注意事项
1. 使用抗CD28抗体对CD28共刺激，可以提高IL-2的分泌
在FluoroSpot实验中，捕获抗体对细胞因子的捕获可能会影响细胞因子的分泌。板孔里包被的IL-2捕获抗体能够降低游离IL-2的分泌，而游离IL-2对T细胞活化是必须的。为了补偿这种影响，可使用抗CD28单抗进行共刺激，在合适的浓度下可以增加特异性抗原的分泌而不会增加自然分泌。其他细胞因子也有可能会受到捕获抗体的影响，因此使用抗CD28抗体刺激在很多情况下可以有效的解决这个问题。
2.建议使用带分离滤光片的自动读板仪分析
建议使用带FITC和Cy3滤光片的自动荧光ELISpot分析仪仪分析FluoroSpot。为了准确的检测2种细胞因子分泌的细胞，分析仪需要具有对2种滤光片获得的信号进行叠加分析的能力。