CAR-T细胞疗法（Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies）是利用患者自身免疫系统来对抗癌症的治疗方法。通过对患者的T细胞进行重新编程，以针对特定的癌症抗原进行靶向治疗。目前FDA已经批准了针对白血病和淋巴瘤等血液肿瘤的6种个性化疗法，CAR-T细胞疗法为以前难以治疗的癌症提供了新的治疗策略。

图1. CAR-T细胞疗法示意图。收集患者的免疫细胞在实验室进行改造，引入嵌合抗原受体(CAR)基因，赋予免疫细胞识别癌细胞并增强它们杀死癌细胞的能力。这些CAR-T细胞在体外进行培养扩增，然后再回输给病人。

根据FDA的总结，细胞因子释放测定在CAR-T细胞产品的开发中是必不可少的，用来确保CAR-T细胞治疗方法的安全性和有效性。Atanackovic[1]等研究者开始利用FluoroSpot在单细胞水平上评估CAR-T细胞产物的功能动力学，将该检测结果与它们的功能表征相结合。

FluoroSpot是一种用于定量细胞分泌的靶标分析物的免疫测定方法。就像ELISpot，细胞分泌的目标蛋白在分泌后立即被特异性抗体捕获，使ELISpot成为一种极其敏感的分析方法。FluoroSpot与ELISpot的区别在于检测模式：ELISpot依靠酶促反应，而FluoroSpot利用荧光。FluoroSpot结合了ELISpot的灵敏度并具有同时检测几种靶标分析物分泌的能力。

图2. FluoroSpot检测方法的一般步骤

在研发过程中如何利用FluoroSpot来检测CAR-T细胞的功能呢？

体外和体内评估对于确保CAR-T细胞治疗效果都很重要。体外效力试验，如细胞毒性、铬释放试验和基于流式细胞术的方法可以评估CAR-T细胞是否具有诱导靶细胞杀伤的能力。理想情况下，CAR-T细胞会在靶癌细胞存在的情况下通过脱粒和细胞因子释放而激活。ELISpot和FluoroSpot在检测IFN-γ、granzyme B、 perforin、 IL-2和 TNF-α分泌细胞方面具有极高的灵敏度，可以成为关键的检测方法。

图3. FluoroSpot评价CAR-T细胞的功能。可以用表达肿瘤相关抗原(TAA)的癌细胞或用TAA本身直接刺激细胞来评估。细胞分泌的IFN-γ、granzyme B、 perforin、 IL-2和 TNF-α可以用 FluoroSpot检测。

评价体内CAR-T细胞治疗效果时，不仅可以通过肿瘤大小的变化、存活率和流式细胞术表型分析来评估，还可以通过使用ELISpot和FluoroSpot的再次应激反应来评估。从动物模型或患者中分离CAR-T细胞，然后用靶癌细胞再次刺激，然后评估脱粒和细胞因子的释放情况。这些技术方法能够帮助描绘CAR-T细胞功能的综合图像，指导临床治疗的成功改进。

CAR-T细胞被认为是有疗效时，就可以在临床试验中评估安全性了。在患者进行CAR-T细胞治疗后，可以分离患者PBMC收集CAR-T细胞，与靶细胞共培养，通过ELISpot或FluoroSpot检测评估它们的功能。检测结果将提示患者或动物模型中CAR-T细胞的输入是否有不良反应。不良反应监测对于评估治疗的安全性和耐受性至关重要。其中细胞因子风暴（cytokine storms）就是较为严重的不良反应事件之一，检测患者或动物血清中的IL-6水平能比较容易地评估此种不良反应。Mabtech能提供IL-6 ELISA, IL-1β ELISA, 和 IL-6/IL-1β FluoroSpot等一系列试剂盒来帮助评估。

前面提到Atanackovic[1]等学者已经开始利用FluoroSpot在单细胞水平上评估CAR-T细胞产物的功能动力学情况，在他们测试的细胞因子组合中，IFN-γ/Granzyme B/TNF-α与表征临床级CD19靶向CAR-T细胞产物最相关。

图4.CD19包被的beads与靶向CD19的CAR-T细胞共培养，使用FluoroSpot检测3个指标IFN-γ/Granzyme B/TNF-α的表达情况。

图5. 将靶向CD19的CAR-T细胞暴露在CD19包被的beads、BCMA包被的beads和CD3/CD28抗体包被的beads、以及无beads的对照组。CD3/CD28抗体包被的beads用作阳性对照。结果显示在CD19包被的beads条件下CAR-T细胞响应明显。

该文章作者提出了使用FluoroSpot作为评估CAR-T产品效力的方法学优势：

1. FluoroSpot可以通过测定抗原特异性T细胞接触靶抗原后细胞因子的分泌情况而定量抗原特异性T细胞，能在单细胞水平上评估CAR-T细胞。

2. FluoroSpot可以检测主动分泌因子的效应细胞数量，而不像细胞因子染色和流式细胞术仅仅检测产生的因子，从而进一步提高了FluoroSpot检测T细胞的临床相关性。

3. FluoroSpot检测具有成本低、操作简便、结果稳定可靠的优势。

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引用文献：[1] Atanackovic et. al., A novel multicolor fluorescent spot assay for the functional assessment of chimeric antigen receptor (CAR) T-cell products, Cytotherapy 2024

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